ds案例 | 醇脱氢酶催化双芳基酮的研究-j9九游会真人游戏第一

双芳基酮是一类制药领域重要的中间体，该酮类化合物需要还原为双芳基醇发挥作用。但由于该酮类化合物具有两个大位阻的芳香侧链，通常很难被还原，被称为“难还原”（difficult-to-reduce）酮类。来自多孢克鲁维酵母（kluyveromyces polyspora）的醇脱氢酶kpadh在还原(4-氯苯基)(2-吡啶基)甲酮（cpmk）时表现出了较高的转化率和中等的立体选择性(82% ee, r)。在此基础上，江南大学倪晔教授团队与中科院上海有机所周佳海研究员合作开展了对kpadh酶进行底物立体选择性改造及催化机制解析的深入研究。

针对底物具有两个大位阻芳环，并且两个芳环具有不同电荷分布的特点，作者提出了“极性扫描”策略（polarity scanning）。分别使用天冬酰胺asn和缬氨酸val作为极性和非极性筛子，通过定点突变获得了kpadh底物结合口袋上与酶催化立体选择性相关的6个重要氨基酸位点；之后作者对这些位点进行单点饱和突变和迭代组合突变，成功获得立体选择性显著提高的突变株mu-r2（99.2% ee，r）和立体选择性翻转的突变株mu-s5（97.8% ee，s）。

表一  野生型和突变株的动力学参数

为了研究酶催化的立体选择性识别机制，作者结晶了野生型kpadh及两个突变体mu-s5和mu-r2结构，通过分析蛋白质晶体结构发现，214位点的突变导致野生型和突变体的蛋白质结构在loop82-96区域存在明显差异。利用discovery studio的cdocker模块，将底物cpmk对接到蛋白结构中发现，突变株通过氨基酸残基极性的改变，诱导底物被还原成具有手性选择的化合物。

后续作者利用discovery studio 的分子动力学程序详细研究并分析了底物与酶之间的相互作用机制。约束条件下的动力学模拟结果显示，对于突变体mu-s5，其底物结合口袋入口处突变位点n136，v161，c237和g214的α-碳原子可形成类平面的“极性门”。由于底物潜在手性碳两侧氯苯环和吡啶环的带电差异，在催化过程中底物的方向在其穿过“极性门”时即被决定。对于野生型kpadh，类似的平面被周围芳香族氨基酸残基的侧链阻挡，从而使底物在接近催化中心时无法保持单一方向。

总结：

基于极性的筛选策略和基于蛋白质晶体结构的计算机模拟是本文研究的亮点。极性筛选策略可用于高立体选择性醇脱氢酶的构建，为制备手性纯双芳基醇提供了高效的生物催化剂；合理的计算机模拟加深了研究者对双芳基醇脱氢酶立体选择性催化机制的理解，为蛋白质工程用于新酶的理性设计提供了理论基础。

为什么选择 ？

1.discovery studio应用广泛，操作简便，图形化界面十分友好，结果易于分析。

2.ds cdocker 首先采用高温动力学的方法随机搜索小分子构象，随后采用模拟退火的方法将各个构象在受体活性位点区域进行优化，从而使对接结果更加准确。

3.在discovery studio这一分子模拟的综合平台中，为用户提供了基于窗口的分子动力学模拟工具。使用ds，用户可以轻松的完成分子动力学的整个模拟过程（包括体系的准备、模拟过程的设置及结果的分析）。另外考虑到初级模拟者在整个模拟流程方面不熟悉，ds专门设置了一个standard dynamics cascade protocol。该protocol将整个动力学模拟的步骤集合到一个参数设置界面当中，方便初级模拟者的使用。